Pronalazak se odnosi na genetski inženjering, biotehnologija, medicina, farmakologija. Nova rekombinantna multikopijska plazmidna DNK pSX50, koja kodira sintezu interferona humanih leukocita alfa-2b, čija je ekspresija pod kontrolom promotora laktoze i triptofana i terminatora transkripcije. Kao rezultat transformacije ćelija soja recipijenta E. coli BL21 sa rekombinantnom plazmidnom DNK pSX50, dobijen je soj E. coli SX50 - proizvođač rekombinantnog leukocitnog humanog alfa-2b interferona sa produktivnošću do 0,9-1,0 g alfa-2b interferon iz 1 litre podloge za kulturu. Metoda za proizvodnju rekombinantnog alfa-2b interferona zasniva se na upotrebi stvorenog rekombinantnog soja E. coli SX50 i uključuje njegovu dubinsku kultivaciju na hranljivoj podlozi sa smanjen sadržaj triptofan uz kontinuirano dodavanje hranjivih supstrata u procesu biosinteze, mehaničko uništavanje ćelija mikroorganizama sa visok krvni pritisak, rastvaranje agregiranog proteina u koncentrovanoj otopini gvanidin hidrohlorida, nakon čega slijedi renaturacija interferona u fiziološkim puferskim otopinama u prisustvu haotropnih agenasa i njegovo pročišćavanje trostupanjskim hromatografskim prečišćavanjem interferona na smolama tipa Chelatating Sepharose Fast Flow imobiliziranim Cu +2 jona, jonoizmenjivačka hromatografija na jonoizmenjivačkim smolama tipa SM. smanjenje uslova kod bojenja gelova srebrom i više od 98% prema RF HPLC i ne sadrži pirogene (LAL test) u količinama od najmanje 400-800 mg po 1 litru podloge. 3 n. i 3 platna mjesta, 6 il.
Crteži za RF patent 2242516
Pronalazak se odnosi na genetski modifikovane lekove dobijene biotehnološkim putem, odnosno na metode industrijska proizvodnja rekombinantni humani leukocitni interferon alfa-2b medicinske svrhe(u daljem tekstu interferon), kao i na rekombinantne sojeve Escherichia coli (E.coli) i plazmidnu DNK koja kodira sintezu interferona.
Interferoni su proteinski molekuli s molekulskom težinom od 15.000 do 21.000 daltona koje proizvode i luče stanice kao odgovor na virusnu infekciju ili druge patogene. Postoje tri glavne grupe interferona: alfa, beta i gama. Ove grupe same po sebi nisu homogene i mogu sadržavati nekoliko različitih molekularnih vrsta interferona. Tako je identifikovano više od 14 genetskih varijanti interferona alfa koje su od interesa i pronalaze široka primena u medicini kao antivirusna, antiproliferativna i imunomodulatorna sredstva.
Poznate su metode za dobijanje humanog leukocitnog interferona iz leukocita krvi humanog donora izazvane virusima i drugim induktorima (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Glavni nedostatak ovih metoda za proizvodnju interferona je vjerovatnoća kontaminacije konačnog proizvoda ljudskim virusima, kao što su virus hepatitisa B i C, virus imunodeficijencije itd.
Trenutno je metoda proizvodnje interferona mikrobiološkom sintezom prepoznata kao perspektivnija, što omogućava dobivanje ciljanog proizvoda sa značajno većim prinosom od relativno jeftinih početnih materijala. Pristupi korišteni ovdje omogućavaju stvaranje varijanti strukturnog gena koje su optimalne za ekspresiju bakterija, kao i regulatornih elemenata koji kontroliraju njegovu ekspresiju.
Početni mikroorganizmi koji se koriste su razni dizajni sojevi Pichia pastoris, Pseudomonas putida i Escherichia coli.
Nedostatak upotrebe P. pastoris kao proizvođača interferona (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //Visoka ekspresija humanog IFN-2b u Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995. ), Uslovi fermentacije ove vrste kvasca su izuzetno teški, potreba da se striktno održava koncentracija induktora, posebno metanola, tokom procesa biosinteze. Nedostatak korištenja Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) je složenost procesa fermentacije na niskom nivou ekspresije (10 mg interferona po 1 litru podloge). Produktivnija je upotreba sojeva Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).
Poznat je veliki broj plazmida i sojeva E. coli stvorenih na njihovoj osnovi koji eksprimiraju interferon: E. coli sojevi ATCC 31633 i 31644 sa plazmidima Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 ili Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli soj pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli soj pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli soj SG 20050 sa plazmidom p280/21FN VK i dr. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, br. 9, str. 1186-1193), soj E. Coli SG 20050 sa plazmidom pINF14 (SU 1703691), soj E. coli SG 20050 sa plazmidom pINF14 (RU4401) i dr. Nedostatak tehnologija zasnovanih na upotrebi ovih sojeva je njihova nestabilnost, kao i nedovoljan nivo ekspresije interferona.
Uz karakteristike korišćenih sojeva, efikasnost procesa u velikoj meri zavisi od tehnologije koja se koristi za izolaciju i prečišćavanje interferona.
Poznata je metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje uzgoj Ps ćelija. putida, uništavanje biomase, tretman polietileniminom, frakcionisanje amonijum sulfatom, hidrofobna hromatografija na fenilsilohromu C-80, pH frakcionisanje lizata, njegova koncentracija i dijafiltracija, jonoizmenjivačka hromatografija na celulozi DE-52, eluiranje u pH gradijentu, ion izmjenjivačka hromatografija dobivenog eluenta na celulozi SM -52, koncentriranje propuštanjem kroz filter kasetu i gel filtracija na Sephadex G-100 (SU 1640996). Nedostatak ove metode, pored složene višestepene fermentacije, je i višestepenost procesa u dobijanju konačnog proizvoda.
Poznata je i metoda za proizvodnju interferona, koja uključuje kultivaciju soja E. coli SG 20050/pIF16 u LB bujonu u tikvicama u termostatiranom šejkeru, centrifugiranje biomase, ispiranje puferskom otopinom i ultrazvučni tretman za uništavanje stanica. Dobiveni lizat se centrifugira, ispere sa 3M rastvorom uree u puferu, rastvori u rastvoru gvanidin hlorida u puferu, obradi ultrazvukom, centrifugira, oksidativnom sulfitolizom, dijalizom protiv 8 M uree, renaturacijom i finalnom dvostepenom hromatografijom na CM- 52 celuloza i Sephadex G-50 (RU 2054041). Nedostaci ove metode su relativno niska produktivnost glavnih faza procesa izolacije i pročišćavanja. Ovo se posebno odnosi na ultrazvučnu obradu proizvoda, dijalizu i oksidativnu sulfitolizu, što dovodi do nestabilnosti u oslobađanju interferona, kao i nemogućnosti upotrebe ove metode za industrijska proizvodnja interferon.
Kao najbliži analog (prototip) može se navesti metoda za dobijanje interferona humanih leukocita, koja se sastoji u kultivaciji rekombinantnog soja E. coli, zamrzavanju nastale biomase na temperaturi koja ne prelazi -70°C, odmrzavanje, uništavanje ćelija mikroorganizama. sa lizozimom, uklanjanjem DNK i RNK uvođenjem u lizat DNK-aze i prečišćavanjem izolovanog nerastvorljivog oblika interferona ispiranjem puferskim rastvorom sa deterdžentima, otapanjem taloga interferona u rastvoru gvanidin hidrohlorida, renaturacijom i jednostepenim prečišćavanjem ionom izmjenjivačka hromatografija. Kao proizvođač koristi se soj E. coli SS5 dobiven korištenjem rekombinantnog plazmida pSS5 koji sadrži tri promotora: P lac , P t7 i P trp i alfa-interferon gen sa uvedenim nukleotidnim supstitucijama.
Ekspresiju interferona od strane E. coli SS5 soja koji sadrži ovaj plazmid kontrolišu tri promotora: P lac , P t7 i P trp . Nivo ekspresije interferona je oko 800 mg po 1 litru ćelijske suspenzije (RU 2165455).
Nedostatak ove metode je niska tehnološka efikasnost upotrebe enzimske destrukcije ćelija, DNK i RNK mikroorganizma i jednostepenog hromatografskog prečišćavanja interferona. To uzrokuje nestabilnost u procesu oslobađanja interferona, dovodi do smanjenja njegove kvalitete i ograničava mogućnost korištenja gornje sheme za industrijsku proizvodnju interferona. Nedostaci ovog plazmida i soja baziranog na njemu su upotreba u plazmidu jakog neregulisanog promotora faga T7 u soju E. coli BL21 (DE3), u kojem se gen T7 RNA polimeraze nalazi ispod promotora lac operon i koji uvijek "teče". Posljedično, u ćeliji se kontinuirano odvija sinteza interferona, što dovodi do disocijacije plazmida i smanjenja vitalnosti ćelija soja, a kao rezultat toga i smanjenja prinosa interferona.
Cilj ovog pronalaska je da se konstruiše rekombinantni industrijski soj E. coli koristeći novu rekombinantnu plazmidnu DNK sa visokim nivoom biosinteze interferona, i da razvije efikasnu industrijsku tehnologiju za proizvodnju interferonske supstance za medicinsku upotrebu, odgovarajućeg kvaliteta. u "Evropsku farmakopeju" za interferon alfa-2b supstancu.
Ovaj problem je rešen stvaranjem rekombinantne plazmidne DNK pSX50 i soja Escherichia coli SX50, deponovanog u Sveruskoj kolekciji industrijskih sojeva Federalnog državnog jedinstvenog preduzeća Državni istraživački institut za genetiku, broj VKPM B-8550,
kao i metodu za proizvodnju rekombinantnog alfa-2b interferona, zasnovanu na upotrebi rekombinantnog soja E. coli SX50 i koji uključuje njegovu dubinsku kultivaciju na hranljivoj podlozi sa smanjenim sadržajem triptofana uz kontinuirano dodavanje hranljivih supstrata u procesu biosinteze, mehaničko uništavanje ćelija mikroorganizama pod visokim pritiskom, otapanje agregiranog proteina u koncentrovanoj otopini gvanidin hidrohlorida, nakon čega slijedi renaturacija interferona u fiziološkim puferskim otopinama u prisustvu haotropnih agenasa i trostepeno hromatografsko pročišćavanje interferona na smolama kao što su kao Chelating Sepharose Fast Flow, imobilizirana sa Cu +2 jonima, hromatografija jonske izmjene na smolama za izmjenu jona kao što je CM Sepharose Fast Flow i gel filtracijska hromatografija na smolama kao što je Superdex 75.
Prema pronalasku, predložena je nova rekombinantna multikopijska plazmidna DNK pSX50, koja kodira sintezu humanog leukocitnog alfa-2b interferona, čija je ekspresija pod kontrolom promotora laktoze i triptofana i terminatora transkripcije. Plazmid pSX50 ima 3218 parova baza (bp) i karakteriše ga prisustvo sledećih fragmenata:
Sekvenca od nukleotida 1 do nukleotida (nt) 176 uključuje fragment DNK od 176 bp koji sadrži promotor triptofana (P trp);
Sekvenca od 177 nt. do 194 n. uključuje sintetički DNK fragment od 18 bp koji sadrži Shine Delgarno sekvencu, odgovornu za inicijaciju translacije;
Sekvenca od 195 nt. do 695 n. uključuje fragment DNK veličine 501 bp koji sadrži sekvencu gena za interferon sa sljedećim nukleotidnim supstitucijama: na poziciji 37, supstitucija A na C, na poziciji 39, supstitucija G na T, na poziciji 40, supstitucija A na C, na poziciji 42, zamjena G u T, na poziciji 67, zamjena A sa C, na poziciji 69, zamjena G sa T, na poziciji 70, zamjena A sa C, na poziciji 72, zamjena A sa T, na poziciji 96, zamena G sa A, na poziciji 100, zamena A sa C, u na poziciji 102, zamena A sa T, na poziciji 114, zamena A sa C, na poziciji 120, zamena C sa G, na poziciji 126, zamjena G sa A, na poziciji 129, zamjena G sa A, na poziciji 330, zamjena C sa G, na poziciji 339 zamjenom G sa A, na poziciji 342 zamjenom G sa A, u pozicija 487 zamjenjuje A sa C, na poziciji 489 zamjenjuje A sa T, na poziciji 495 zamjenjuje G sa A;
Sekvenca od 696 nt. prema 713 n. uključuje sintetički DNK fragment od 18 bp koji sadrži sintetički polilinker;
Sekvenca od 714 nt. do 1138 n. uključuje fragment DNK plazmida pKK223-3 sa 4129 nt. do 4553 n. veličine 425 bp, koji sadrži sekvencu terminatora striktne transkripcije rrnBT 1 T 2;
Slijed iz 1139. b. do 1229 n. uključuje fragment DNK plazmida pUC19 sa 2487 nt. do 2577 n. veličine 91 bp, koji sadrži promotor gena β-laktomaze (gen otpornosti na ampicilin - Amp R);
Slijed iz 1230. b. do 2045 n. uključuje fragment DNK plazmida pUC4K sa 720 nt. do 1535. godine veličine 816 bp, koji sadrži strukturni region kan gena;
Slijed iz 2046. b. do 3218 n. uključuje fragment DNK plazmida pUC19 od 1625 do 453 nt. Veličine 1173 bp, koji sadrži sekvencu odgovornu za replikaciju plazmida (ori) i lac promotor (P lac).
Na slikama 1-5 prikazani su dijagrami dizajna i fizička karta pSH50 plazmidi.
Slika 6 prikazuje kompletnu sekvencu nukleotida određena za plazmid pSX50.
Escherichia coli soj SX50 dobijen je transformacijom ćelija Escherichia coli BL21 sa plazmidom pSX50 koristeći tradicionalnu tehnologija genetskog inženjeringa. Soj E.Coli SX50 karakteriziraju sljedeće karakteristike.
Kulturološke i morfološke karakteristike
Ćelije su male, ravne, zadebljane štapićaste, gram-negativne, ne nose spore. Ćelije dobro rastu na jednostavnim hranljivim medijima. Prilikom uzgoja na Difco agaru formiraju se okrugle, glatke, konveksne, mutne, sjajne, sive kolonije sa glatkim rubovima. Kada se uzgaja u tečnom mediju (u minimalnoj podlozi sa glukozom ili u LB bujonu), formira se intenzivna, ujednačena zamućenost.
Fizičke i biološke karakteristike
Aerobe. Raspon temperature za rast je 4-42°C sa optimalnim pH od 6,5-7,5.
Kao izvor azota koriste se i mineralne soli u amonijumskom i nitratnom obliku, kao i organska jedinjenja u obliku aminokiselina, peptona, triptona, ekstrakta kvasca itd.
Kao izvor ugljika koriste se aminokiseline, glicerol i ugljikohidrati. Otpornost na antibiotike. Ćelije pokazuju otpornost na kanamicin (do 100 μg/ml).
Escherichia coli soj 8X50 je proizvođač interferona.
Metoda, uslovi i sastav medijuma za skladištenje soja
U L-arapeu sa dodatkom kanamicina u koncentraciji od 20 mcg/ml pod uljem, u L-juhi koja sadrži 15% glicerola i odgovarajućih antibiotika u ampulama na temperaturi od minus 70°C, u liofiliziranom stanju u ampulama na temperatura od plus 4°C.
Escherichia coli soj SX50 identifikovan je prema Bergey's Guide (1974) kao soj vrste Escherichia coli.
Metoda industrijske proizvodnje alfa-2b interferona
Značajka predložene metode je razvoj tehnologije koja omogućava izolaciju interferona iz nerastvornog oblika koji se akumulira tokom fermentacije, što omogućava značajno pojednostavljenje tehnološka šema proces izolacije i povećanje prinosa ciljnog proizvoda.
Metoda se sastoji od kultivacije soja Escherichia coli SH50 u hranljivoj podlozi, uz stalno dodavanje hranljivih supstrata, najbolje glukoze i ekstrakta kvasca, u procesu biosinteze, po mogućnosti sa smanjenim sadržajem triptofana, mehaničkog uništavanja ćelija mikroorganizama pod visokim pritiskom. 700-900 bara, rastvaranje interferona u puferskom rastvoru gvanidin hidrohlorida, renaturacija interferona u fiziološkim puferskim rastvorima u prisustvu haotropnih agenasa, praćeno trostepenim hromatografskim prečišćavanjem interferona na smolama tipa kelirajuća sefaroza Fast Flow imobilisana sa Cu +2 joni, jonoizmenjivačka hromatografija na CM Sepharose Fast Flow jonoizmenjivačkim smolama i gel filtraciona hromatografija na smolama kao što je Superdex 75.
Optimalni uslovi za provođenje pojedinačnih faza proizvodnje interferona su sljedeći:
Fermentacija se odvija uz kontinuirano dodavanje supstrata kroz cijeli proces, što opredjeljuje visoki nivo ekspresija interferona;
Uništavanje ćelije se vrši u dezintegratoru tipa Gaulin pod pritiskom od 900 bara;
Uklanjanje rastvorljivih ćelijskih komponenti (DNK, RNK, proteina, lipopolisaharida itd.) vrši se ispiranjem nerastvorljivog oblika interferona puferskim rastvorima koji sadrže deterdžente (Triton XI00, urea, itd.);
Nastali precipitat koji sadrži interferon se otopi u puferskom rastvoru 6 M gvanidin hidrohlorida;
Renaturacija interferona se provodi u fiziološkom puferskom rastvoru koji sadrži haotropna sredstva;
Trostepeno hromatografsko prečišćavanje interferona je izvedeno na Chelating Sepharose Fast Flow, imobilizovanoj Cu +2 jonima, na smoli za izmjenjivanje katjona SM Sepharose Fast Flow i gel filtracionoj hromatografiji na smoli tipa Superdex 75;
Nakon svakog hromatografskog prečišćavanja, vrši se sterilizaciono filtriranje kroz filtere bez pirogena sa veličinom pora od 0,22 mikrona.
Prinos interferona kao rezultat primjene opisane metode je približno 400-800 mg interferona po 1 litru podloge za kulturu. Kvalitet dobivenog proizvoda je u skladu sa standardima i zahtjevima "Evropske farmakopeje" za supstancu alfa-2b interferon.
Značajne razlike između predložene metode i prototipa su:
Upotreba dizajna soja sa većom produktivnošću, koji omogućava dobijanje veće količine interferona iz 1 litre podloge za kulturu tokom biosinteze;
Upotreba efikasnog mehaničkog uništavanja stanične biomase, što omogućava dobijanje čistijeg ekstrakta nerastvorljivog oblika interferona za više kratko vrijeme, sa manjim gubicima;
Upotreba fizioloških puferskih rastvora tokom renaturacije u prisustvu haotropnih agenasa omogućava povećanje prinosa pravilno renaturisanog oblika interferona;
Trostepeno hromatografsko pročišćavanje interferona omogućava da se dobije interferonska supstanca sa više od 99% čistoće prema elektroforezi u redukcionim i neredukcionim uslovima pri bojenju gelova srebrom i više od 98% prema RF HPLC i praktično bez pirogena (LAL test).
Suštinu i prednosti grupe pronalazaka za koju se traži zaštita ilustruju sledeći primeri.
Primjer 1. Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSH50
Metoda za konstruisanje plazmida pSX50 uključuje sljedeće korake:
Konstrukcija vektorskog plazmida pSX10;
1. konstrukcija plazmida pSX3 (2641 bp)
2. konstrukcija vektorskog plazmida pSX10 (2553 bp)
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX41 (3218 bp);
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX43 (3218 bp);
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX45 (3218 bp);
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX50 (3218 bp).
Konstrukcija vektorskog plazmida pSX10
Vektorski plazmid pSX10 je pUC19 vektor u kojem je kodirajuća sekvenca gena beta laktomaze, koja pruža otpornost na ampicilin, zamijenjena kodirajućom sekvencom kan gena i sadrži terminator transkripcije iz plazmida pKK223-3.
Konstrukcija vektorskog plazmida pSS10 odvija se u dvije faze:
Priprema plazmida pSX3 (2641 bp), koji je plazmid pUC19, u kojem je kodirajuća regija amp gena zamijenjena kodirajućom regijom kan gena;
Priprema vektorskog plazmida pSX10 (2553 bp), koji je plazmid pSX3 u kojem je fragment DNK koji kodira terminator transkripcije rBT 1 T 2 umetnut iza BamHI mjesta.
Izvedeno je pet krugova amplifikacije DNK da bi se dobio plazmid pSX3. PCR metoda(lančana reakcija polimeraze). Tokom prvog kruga, koristeći pUC19 plazmidnu DNK kao šablon, umnožava se fragment DNK veličine 1828 bp. (fragment PU1-PU2) pomoću prajmera:
Ova i sljedeće PCR reakcije se izvode pod sljedećim uvjetima: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, 0,2 mM svakog dNTP, 1,25 jedinica. Pfu DNK polimeraza, 100 ng DNK. Proces amplifikacije se sastoji od sljedećih faza: zagrijavanje na 95°C 5 min, 35 PCR ciklusa (30 sekundi 95°C, 30 sekundi 56°C, 2 min 72°C) i inkubacija 10 min na 72°C. Nakon amplifikacije (i nakon naknadnih amplifikacija), fragment DNK se pročišćava elektroforezom u 1% agaroznom gelu. Tokom druge i treće runde, koristeći pUC4K plazmidnu DNK kao šablon, 555 bp DNK fragment je amplificiran. (fragment KM1-KM2) upotrebom prajmera:
i amplifikacija fragmenta DNK od 258 bp. (KMZ-KM4) od prajmera
U petoj rundi PCR-a, fragmenti (PU1-PU2) i (KM1-KM4) se kombinuju pod sledećim uslovima: zagrevanje na 95°C 5 min, 5 PCR ciklusa (30 sekundi 95°C, 30 sekundi 56°C , 10 min 72°C) i inkubacija 10 min na 72°C. DNK dobijena posle poslednjeg PCR-a se direktno transformiše u ćelije E. coli soja DH5 i postavlja na LA medijum koji sadrži 20 μg/ml kanamicina. Nakon inkubacije od 12 sati na 37°C, klonovi se eliminišu, izoluje se plazmidna DNK i radi se restrikciona analiza. Kao rezultat, dobija se plazmid pSX3 veličine 2641 bp.
Da bi se dobio vektorski plazmid pSX10, izvedena su tri kruga amplifikacije DNK pomoću PCR-a. U prvom krugu, koristeći pSX3 plazmidnu DNK kao šablon, umnožava se fragment DNK od 2025 bp. (fragment 10.1-10.2) upotrebom prajmera:
Tokom drugog kruga, koristeći DNK plazmida pKK223-3 kao šablon, umnožava se fragment DNK veličine 528 bp. (fragment KK1-KK2) upotrebom prajmera:
U trećem krugu PCR-a, fragmenti (10.1-10.2) i (KK1-KK2) se kombinuju pod sledećim uslovima: zagrevanje na 95°C 5 minuta, 5 PCR ciklusa (30 sekundi 95°C, 30 sekundi 56°C , 10 min 72°C) i inkubacija 10 min na 72°C. DNK dobijena posle poslednjeg PCR-a se direktno transformiše u ćelije E. coli soja DH5 i postavlja na LA medijum koji sadrži 20 μg/ml kanamicina. Nakon inkubacije od 12 sati na 37°C, klonovi se eliminišu, izoluje se plazmidna DNK i radi se restrikciona analiza. Kao rezultat, dobija se plazmid pSX10 veličine 2553 bp.
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX41
Rekombinantni plazmid pSX41 je Hind III - BamHI DNK fragment vektorskog plazmida pSX3 (2529 bp), Hind III - EcoRI DNK fragment od 168 bp, koji kodira promotor triptofanskog operona E. coli (P trp), EcoRI-XbaI sintetički DNK fragment od 20 bp koji kodira SD sekvencu (Shine-Delgarno) i XbaI-BamHI DNK fragment od 501 bp koji kodira gen za humani interferon alfa 2b.
Da bi se dobio Hind III - BamHI DNK fragment vektorskog plazmida pSX3 (2529 bp), DNK plazmida pSX3 se tretira restrikcijskim enzimima HindIII i BamHI, nakon čega slijedi elektroforetsko prečišćavanje u 1% agaroznom gelu. Hind III EcoRI DNK fragment od 168 bp koji kodira promotor triptofanskog operona (P trp) dobije se PCR-om koristeći ukupnu E. coli DNK kao šablon i prajmere TRP1 i PRP2, nakon čega slijedi tretman amplificiranog fragmenta Hindll i EcoRI restrikcijom enzimi:
Da bi se EcoRI-Xbal dobio sintetički DNK fragment od 20 bp koji kodira SD sekvencu (Shine-Delgarno), sintetizirani su sljedeći komplementarni oligonukleotidi:
XbaI-BamIII DNK fragment veličine 501 bp, koji kodira gen za humani alfa 2b interferon, dobije se PCR-om koristeći ukupnu ljudsku DNK kao šablonu i prajmere IFN1 i IFN2, nakon čega slijedi obrada umnoženog fragmenta sa Xbal i BamIII restrikcijskim enzimima:
Zatim se elektroforetski pročišćeni fragmenti kombinuju, ligiraju sa enzimom T4 fag ligaze, DNK se transformiše u ćelije soja E. coli DH5 i nanese na LA medijum koji sadrži 20 μg/ml kanamicina. Nakon inkubacije od 12 sati na 37°C, klonovi se eliminišu, izoluje se plazmidna DNK, vrši se restrikciona analiza i određuje primarna struktura DNK. Kao rezultat, dobija se plazmid pSX41 veličine 3218 bp. Zatim se provodi mutageneza gena za interferon korak po korak kako bi se povećao nivo ekspresije ciljnog proizvoda. Mutageneza gena za interferon sastoji se od zamjene tripleta koji se rijetko nalaze u E. coli, koji kodiraju odgovarajuće aminokiseline, sa tripletima koji se često nalaze u E. coli, koji kodiraju iste aminokiseline. DNK mutageneza gena za interferon provodi se PCR metodom.
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX43
Da bi se dobio rekombinantni plazmid pSX43, jedan krug amplifikacije DNK se izvodi PCR-om koristeći DNK plazmida pSX41 kao šablon i prajmere IFN3 i IFN4:
PCR se izvodi pod sledećim uslovima: zagrevanje na 95°C 5 min, 20 PCR ciklusa (30 sec 95°C, 30 sekundi 56°C, 10 min 72°C) i inkubacija 20 min na 72°C. DNK dobijena nakon PCR-a se direktno transformiše u ćelije E. coli soja DH5 i stavi na LA medijum koji sadrži 20 μg/ml kanamicina. Nakon inkubacije od 12 sati na 37°C, klonovi se eliminišu, izoluje se plazmidna DNK, vrši se restrikciona analiza i određuje primarna struktura DNK. Kao rezultat, dobija se plazmid pSX43 veličine 3218 bp.
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX45
Da bi se dobio rekombinantni plazmid pSX45, jedan krug amplifikacije DNK se izvodi PCR-om koristeći DNK plazmida pSX43 kao šablon i prajmere IFN5 i IFN6:
PCR se izvodi pod sledećim uslovima: zagrevanje na 95°C 5 min, 20 PCR ciklusa (30 sec 95°C, 30 sekundi 56°C, 10 min 72°C) i inkubacija 20 min na 72°C. DNK dobijena nakon PCR-a se direktno transformiše u ćelije E. coli soja DH5 i stavi na LA medijum koji sadrži 20 μg/ml kanamicina. Nakon inkubacije od 12 sati na 37°C, klonovi se eliminišu, izoluje se plazmidna DNK, vrši se restrikciona analiza i određuje primarna struktura DNK. Kao rezultat, dobija se plazmid pSX45 veličine 3218 bp.
Konstrukcija rekombinantnog plazmida pSX50.
Da bi se dobio rekombinantni plazmid pSX50, jedan krug amplifikacije DNK se izvodi PCR-om koristeći DNK plazmida pSX45 kao šablon i prajmere IFN7 i IFN8:
PCR se izvodi pod sledećim uslovima: zagrevanje na 95°C 5 min, 20 PCR ciklusa (30 sec 95°C, 30 sekundi 56°C, 10 min 72°C) i inkubacija 20 min na 72°C. DNK dobijena nakon PCR-a se direktno transformiše u ćelije E. coli soja DH5 i stavi na LA medijum koji sadrži 20 μg/ml kanamicina. Nakon inkubacije od 12 sati na 37°C, klonovi se eliminišu, izoluje se plazmidna DNK, vrši se restrikciona analiza i određuje primarna struktura DNK. Kao rezultat, dobija se plazmid pSX50 veličine 3218 bp.
Primjer 2. Priprema soja E. coli SX50 - proizvođača interferona
Soj E. coli SX50 koji proizvodi interferon dobija se transformacijom ćelija soja E. coli BL21 sa rekombinantnim plazmidom pSX50. Soj koji proizvodi interferon uzgaja se u fermentoru od 30 litara do optičke gustoće od 25,0-30,0 p.u. u medijumu M9 koji sadrži 1% hidrolizata kazeinske kiseline (Difco), 1% glukoze, 40 µg/ml kanamicina, na temperaturi od 38-39°C. Tokom procesa fermentacije, vrši se kontinuirano dodavanje hranjivog supstrata pomoću gravimetrijskog kontrolera.
Primer 3. Metoda za izolovanje interferona iz E. coli soja SX50
Interferon se dobija u 4 faze:
Faza 1. Uzgoj E. coli soja SX50.
Faza 2. Izolacija i pročišćavanje nerastvorljivog oblika interferona.
Faza 3. Otapanje i renaturacija interferona.
Faza 4. Kromatografsko prečišćavanje interferona.
Faza 1. Uzgoj E. coli soja SX50
Uzgojen inokulum E. coli soja SX50 u zapremini od 3 litre bogate LB podloge tokom 12 sati na 26°C aseptički se unosi u fermenter koji sadrži 27 litara sterilne podloge koja sadrži M9, 1% hidrolizat kazeinske kiseline, 1% glukoze, 1 mM MgCl 2, 0,1 mM CaCl 2, 40 mg/ml kanamicina. Kultivacija u fermentoru se vrši na temperaturi od 38-39°C, uz održavanje pH vrednosti od 7±0,15 automatskom titracijom sa 40% rastvorom natrijum hidroksida. Koncentracija rastvorenog kiseonika u opsegu (50±10)% zasićenja održava se promenom brzine mešalice sa 100 na 800 o/min i dovodom vazduha od 1 do 15 l/min. Koncentracija supstrata, posebno glukoze i ekstrakta kvasca, mjeri se tokom fermentacije i njihova koncentracija se održava mijenjanjem brzine dovoda koncentriranih otopina kroz peristaltičke pumpe pomoću gravimetrijskog kontrolera.
Akumulacija interferona u nerastvorljivom obliku prati se fazno-kontrastnom mikroskopom, elektroforezom u 15% poliakrilamidnom gelu (SDS-PAAG) i hromatografijom visokih performansi reverzne faze (RF HPLC). Fermentacija se zaustavlja kada se dostigne maksimalna optička gustoća (~ 25-30 p.u.) i prestane sinteza interferona. Na kraju fermentacije, tečnost kulture se odvaja centrifugiranjem u protočnom rotoru pri brzini rotacije od 5000-10000 o/min. Biomasa je upakovana plastične kese i zamrznuti na minus 70°C.
Faza 2. Izolacija i pročišćavanje nerastvorljivog oblika interferona
300-400 g smrznute biomase E. coli soja SX50 suspendirano je u 3000 ml pufera 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100). Suspenzija se propušta kroz homogenizator protoka Gaulinovog tipa, održava pritisak od 900 bara i centrifugira u protočnom rotoru na 15.000 o/min. Dobijeni talog je ispran pod sličnim uslovima uzastopno puferima 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M urea) i puferom 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) i na kraju interferonom. precipitat se suspenduje u 200 ml pufera 3. U ovom slučaju, vrijeme za izolaciju i prečišćavanje nerastvornog oblika interferona nije više od 5 sati.
Faza 3. Otapanje i renaturacija interferona
U suspenziju nerastvornog oblika interferona dobijenog u prethodnoj fazi, dodati suvi gvanidin hidrohlorid do koncentracije od 6 M, dodati ditiotreitol do koncentracije od 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 do koncentracije od 50 mM, NaCl do koncentracije od 50 mM. koncentraciji od 150 mM i Triton X100 do koncentracije od 0,1%, inkubirati na sobnoj temperaturi 2 sata.Neotopljeni materijal se odvaja sterilizacijom filtracijom kroz membrane prečnika pora od 0,22 mikrona.
Renaturacija interferona se vrši polaganim razblaživanjem dobijenog rastvora 100-200 puta puferom 4 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Nakon toga se renaturaciona smjesa inkubira uz stalno miješanje 12-15 sati na temperaturi od 4-8°C. Zatim se dodaje magnezijum sulfat do koncentracije od 1 mM i agregirani materijal se uklanja sterilizacijom filtriranjem kroz membranski filter s prečnikom pora od 0,22 mikrona.
Faza 4. Kromatografsko prečišćavanje interferona
Kromatografsko prečišćavanje interferona se provodi u tri faze.
1. Rezultirajući renaturisani interferon se prvo pročišćava afinitetnom hromatografijom na smoli s brzim protokom helatne sefaroze (Amersham Biosciences) imobiliziranoj sa Cu +2 jonima. Da bi se to uradilo, rastvor interferona se nanosi na kolonu sa brzim protokom sefaroze Cu +2 i interferon se eluira sa 0,1 M puferom limunska kiselina pH 2.2.
2. U drugoj fazi hromatografskog prečišćavanja, rastvor interferona se nanosi na CM Sepharose Fast Flow tipa kationske izmenjivačke smole (Amersham Biosciences) i interferon se eluira sa gradijentom rastvora (0,0-0,5 M NaCl) u 50 mM Na(CH 3 COO) pufer, pH 5,5.
3. Prečišćavanje monomernog oblika interferona od ostataka polimernih oblika interferona vrši se u trećoj fazi interferonskog prečišćavanja gel filtracijom na Superdex 75 smoli (Amersham Biosciences). Kromatografija se izvodi u puferu od 50 mM Na(CH 3 COO), pH 5,0, koji sadrži 0,15 M NaCl.
Opisanim metodom izolacije i prečišćavanja interferona moguće je dobiti 4-8 g visoko prečišćenog interferona u jednom ciklusu izolacije tokom 7-10 dana iz biomase dobijene iz 10 litara podloge za kulturu. Kvalitet dobijenog interferona u potpunosti je u skladu sa zahtjevima “Evropske farmakopeje” za supstancu interferona alfa-2b, a to su:
Koncentracija interferona nije manja od 2×10 8 IU/ml;
Specifična aktivnost interferona nije manja od 2,0×10 8 IU/mg;
Elektroforetska čistoća lijeka je najmanje 99% u redukcijskim i neredukcijskim uvjetima kada se gelovi boje srebrom;
Izoelektrična tačka izolovanog interferona je u području pH 5,8-6,3;
Peptidna mapa izolovanog interferona se suštinski ne razlikuje od mape peptida za evropski standardni interferon alfa 2b CRS;
Kao što slijedi iz navedenih primjera, grupa izuma za koju se traži zahtjev omogućava dobijanje interferona alfa-2b sa visokim prinosom korištenjem relativno jednostavne i pouzdane tehnologije.
TVRDITI
1. Rekombinantna plazmidna DNK pSX50, koja kodira sintezu rekombinantnog humanog alfa-2b interferona, karakterizirana time što ima veličinu od 3218 baznih parova (bp) i sastoji se od sljedećih fragmenata: sekvenca od 1 do 176 nukleotida (bp) uključuje fragment DNK veličine 176 bp koji sadrži promotor triptofana (P trp), sekvenca od 177 do 194 nt. uključuje sintetički DNK fragment veličine 18 bp koji sadrži sekvencu Shine Delgarno, odgovornu za inicijaciju translacije, sekvencu od 195 do 695 nt. uključuje fragment DNK od 501 bp koji sadrži interferon alfa-2b gen sa nukleotidnim supstitucijama: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A> C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A>S) ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C) , 489 (A>T), 495 (G>A), sekvenca od 696 do 713 nt. uključuje sintetički DNK fragment od 18 bp koji sadrži sintetički polilinker, sekvenca od 714 do 1138 nt. uključuje fragment DNK plazmida pKK223-3 od 4129 do 4553 nt. veličine 425 bp, koji sadrži sekvencu terminatora striktne transkripcije rrnBT 1 T 2, sekvencu od 1139 do 1229 nt. uključuje fragment DNK plazmida pUC19 od 2487 do 2577 nt. veličine 91 bp, koji sadrži promotor gena -laktomaze (gen otpornosti na ampicilin -Amp R), sekvencu od 1230 do 2045 nt. uključuje fragment DNK plazmida pUC4K sa 720 nt. do 1535. godine veličine 816 bp, koji sadrži strukturni region kan gena, sekvencu sa 2046 bp. do 3218 n. uključuje fragment DNK plazmida pUC19 od 1625 do 453 nt. Veličine 1173 bp, koji sadrži sekvencu odgovornu za replikaciju plazmida (ori) i lac promotor (P lac).
2. Bakterijski soj Eschcerichia coli SX50 transformiran rekombinantnim plazmidom prema zahtjevu 1 je proizvođač rekombinantnog humanog leukocitnog interferona alfa-2b.
3. Metoda za proizvodnju humanog interferona alfa-2b, uključujući kultivaciju soja Escherichia coli SX5 prema zahtjevu 2 u hranljivoj podlozi sa stalnim dodavanjem hranljivih supstrata tokom procesa biosinteze, mehaničko uništavanje ćelija mikroorganizama pod pritiskom od 700- 900 bara, rastvaranje interferona u puferskom rastvoru gvanidin hidrohlorida, renaturacija interferona u fiziološkim puferskim rastvorima u prisustvu haotropnih agenasa, trostepeno hromatografsko prečišćavanje interferona na smolama tipa kelirajuća sefaroza Fast Flow imobilisana sa Cu +2 jonima, jonska izmena hromatografija na CM Sepharose Fast Flow tip ionizmjenjivačkih smola i gel filtracijska hromatografija na smolama tipa Superdex 75.
4. Metoda prema zahtjevu 3, naznačena time, da se kultivacija vrši na hranljivom mediju sa smanjenim sadržajem triptofana uz kontinuirano dodavanje hranjivih supstrata, poželjno glukoze i ekstrakta kvasca.
5. Metoda prema zahtjevu 3, u kojoj se prije rastvaranja interferona prečišćava uklanjanjem rastvorljivih ćelijskih komponenti, uključujući DNK, RNK, proteine, lipopolisaharide, ispiranjem puferskim rastvorima koji sadrže deterdžente kao što je Triton XI 00, urea.
6. Metoda prema patentnom zahtjevu 3, u kojoj se nakon svakog hromatografskog prečišćavanja, sterilizirajuća filtracija provodi kroz filtere s veličinom pora od 0,22 mikrona.
U kliničkim studijama sprovedenim sa širok raspon indikacijama i sa širokim rasponom doza (od 6 miliona IU/m2 tjedno - za leukemiju dlakavih ćelija; do 100 miliona IU/m2 sedmično - za melanom), najčešći neželjeni događaji bili su groznica, umor, glavobolja, mijalgija. Groznica i umor su se povukli 72 sata nakon prestanka uzimanja lijeka. Iako groznica može biti jedan od simptoma sindroma sličnog gripi koji se često susreće pri liječenju interferonom, treba izvršiti evaluaciju kako bi se isključili drugi. mogući razlozi uporna groznica.
Sljedeći sigurnosni profil dobijen je od 4 kliničkim ispitivanjima kod pacijenata sa hroničnim hepatitisom C koji su primali Intron A kao monoterapiju ili u kombinaciji sa ribavirinom tokom 1 godine. Svi pacijenti su primali 3 miliona IU Introna A 3 puta sedmično.
Tabela 2 prikazuje nuspojave koje se javljaju u učestalosti većoj ili jednakoj 10% kod pacijenata koji prethodno nisu liječeni koji su primali Intron A (ili Intron A u kombinaciji sa ribavirinom) tokom 1 godine. Općenito, uočeni neželjeni događaji su bili blagi ili umjereni.
Tabela 2.
| Neželjeni događaji | Intron A (n=806) | Intron A + ribavirin (n=1010) |
| Lokalne reakcije | ||
| Upalne reakcije na mestu injekcije | 9–16% | 6–17% |
| Druge reakcije na mjestu injekcije | 5–8% | 3–36% |
| Opće reakcije | ||
| Glavobolja | 51–64% | 48–64% |
| Umor | 42–79% | 43–68% |
| Jeza | 15–39% | 19–41% |
| Vrućica | 29–39% | 29–41% |
| Sindrom sličan gripi | 19–37% | 18–29% |
| Asthenia | 9–30% | 9–30% |
| Gubitak težine | 6–11% | 9–19% |
| Reakcije iz gastrointestinalnog trakta | ||
| Mučnina | 18–31% | 25–44% |
| Anoreksija | 14–19% | 19–26% |
| Dijareja | 12–22% | 13–18% |
| Bol u stomaku | 9–17% | 9–14% |
| Povraćanje | 3–10% | 6–10% |
| Reakcije mišićno-koštanog sistema | ||
| Mijalgija | 41–61% | 30–62% |
| Artralgija | 25–31% | 21–29% |
| Bol u kostima i mišićima | 15–20% | 11–20% |
| Reakcije centralnog nervnog sistema | ||
| Depresija | 16–36% | 25–34% |
| Razdražljivost | 13–27% | 18–34% |
| Nesanica | 21–28% | 33–41% |
| Anksioznost | 8–12% | 8–16% |
| Oštećena sposobnost koncentracije | 8–14% | 9–21% |
| Emocionalna labilnost | 8–14% | 5–11% |
| Kožne reakcije | ||
| Alopecija | 22–31% | 26–32% |
| Svrab | 6–9% | 18–37% |
| Suva koža | 5–8% | 5–7% |
| Osip | 10–21% | 15–24% |
| Reakcije spolja respiratornog sistema | ||
| faringitis | 3–7% | 7–13% |
| Kašalj | 3–7% | 8–11% |
| dispneja | 2–9% | 10–22% |
| Drugi | ||
| Vrtoglavica | 8–18% | 10–22% |
| Virusna infekcija | 0–7% | 3–10% |
Neželjeni događaji uočeni kod pacijenata sa virusni hepatitis C, odgovaraju onima koje su zabilježene kada se koristi Intron A za druge indikacije s određenim povećanjem učestalosti razvoja ovisno o dozi.
Kada se Intron A koristi za druge indikacije (u kliničkim i nekliničkim studijama) rijetko (|1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Iz tijela u cjelini. Vrlo rijetko - oticanje lica.
Astenična stanja (astenija, malaksalost i umor), dehidracija, lupanje srca, psorijaza, gljivične infekcije i bakterijska infekcija(uključujući sepsu).
Od imunološkog sistema. Vrlo rijetko - sarkoidoza ili njena egzacerbacija.
Prijavljeni su različiti autoimuni i imunološki posredovani poremećaji upotrebom alfa interferona, uključujući idiopatsku ili trombotičnu trombocitopenijsku purpuru, reumatoidni artritis, sistemski eritematozni lupus, vaskulitis i Vogt-Koyanagi-Harada sindrom.
Slučajevi su prijavljeni akutne reakcije preosjetljivost, uključujući urtikariju, angioedem i anafilaksiju.
Izvana kardiovaskularnog sistema: retko - aritmija (obično se javlja kod pacijenata sa anamnezom prethodnih bolesti kardiovaskularnog sistema ili sa prethodnom kardiotoksičnom terapijom), prolazna reverzibilna kardiomiopatija (zapažena kod pacijenata bez opterećene anamneze kardiovaskularnog sistema); vrlo rijetko - arterijska hipotenzija, ishemija miokarda i infarkt miokarda.
Iz centralnog i perifernog nervnog sistema nervni sistem. Rijetko - suicidalne tendencije; vrlo rijetko - agresivno ponašanje, uključujući one usmjerene na druge ljude, pokušaji samoubistva, samoubistvo, psihoze (uključujući halucinacije), oštećenje svijesti, neuropatija, polineuropatija, encefalopatija, cerebrovaskularna ishemija, cerebrovaskularna krvarenja, periferna neuropatija, konvulzije.
Sa strane slušnog organa. Vrlo rijetko - gubitak sluha.
Iz endokrinog sistema. Vrlo rijetko - dijabetes melitus, pogoršanje postojećeg dijabetes melitus.
Iz gastrointestinalnog trakta. Vrlo rijetko - pankreatitis, povećan apetit, krvarenje desni, kolitis.
Iz jetre i žučnih puteva. Vrlo rijetko - hepatotoksičnost (uključujući fatalan).
Promjene na zubima i parodoncijumu. Kod pacijenata koji su primali kombinovanu terapiju Nitronom A i ribavirinom bilo je patoloških promjena od zuba i parodoncijuma. Suva usta dugo vremena kombinovana terapija ribavirin i Intron A mogu doprinijeti oštećenju zuba i oralne sluznice. Pacijenti treba da peru zube dva puta dnevno i redovno idu na stomatološke preglede. Osim toga, neki pacijenti mogu iskusiti povraćanje.
Sa strane metabolizma. Rijetko - hiperglikemija, hipertrigliceridemija.
Iz mišićno-koštanog sistema. Rijetko - rabdomioliza (ponekad teška), grčevi u nogama, bol u leđima, miozitis.
Sa strane kože. Vrlo rijetko - multiformni eritem, Stevens-Johnsonov sindrom, toksična epidermalna nekroliza, nekroza na mjestu injekcije.
Iz respiratornog sistema. Rijetko - pneumonija; vrlo rijetko - plućni infiltrati, pneumonitis.
Iz urinarnog sistema. Vrlo rijetko - nefrotski sindrom, bubrežna disfunkcija, zatajenje bubrega.
Iz hematopoetskog sistema. Vrlo rijetko, kada se Intron A koristi kao monoterapija ili u kombinaciji s ribavirinom, uočena je aplastična anemija i potpuna crvena aplazija. koštana srž.
Sa strane organa vida. Rijetko - krvarenje u retini, fokalne promjene na fundusu, tromboza arterija i vena retine, smanjena vidna oštrina, smanjena vidna polja, neuritis optički nerv, edem papile.
Klinički značajne promjene laboratorijski parametri.(češće primećeno kada je lek propisan u dozama većim od 10 miliona IU/dan) - smanjenje broja granulocita i leukocita, smanjenje nivoa hemoglobina i broja trombocita, povećanje aktivnosti alkalne fosfataze, LDH , nivo kreatinina i azota ureje u serumu. Povećanje aktivnosti ALT i AST u krvnoj plazmi bilježi se kao patološko kada se koristi za sve indikacije osim hepatitisa, kao i kod nekih pacijenata s kroničnim hepatitisom B u odsustvu HBV DNK.
Ako se štetni događaji razviju tokom upotrebe Introna A za bilo koju indikaciju, dozu treba smanjiti ili liječenje treba privremeno prekinuti dok se neželjeni događaji ne eliminišu. Ako se razvije uporna ili ponavljajuća netolerancija na adekvatan režim doziranja ili bolest napreduje, terapiju Intronom A treba prekinuti. Uz parenteralnu primjenu lijeka moguća je zimica, groznica, umor, glavobolja, malaksalost i sindrom sličan gripi. Ove nuspojave djelimično ublažavaju paracetamol ili indometacin.
At lokalna aplikacija lijeka na sluznicu oka, moguća je infekcija konjunktive, hiperemija sluznice oka, pojedinačni folikuli, oticanje konjunktive donjeg forniksa.
Prilikom primjene lijeka moguća su odstupanja od normalnih laboratorijskih parametara, koja se manifestiraju leukopenijom, limfopenijom, trombocitopenijom, povišenim razinama alanin aminotransferaze, alkalne fosfataze. Za pravovremeno otkrivanje ovih odstupanja tokom terapije, op klinička ispitivanja analize krvi se moraju ponavljati svake 2 sedmice, a biohemijske pretrage svake 4 sedmice. Općenito, ove promjene su obično male, asimptomatske i reverzibilne.
Nuspojave interferona beta.
Leukopenija. Trombocitopenija. Anemija. Autoimuna hemoliza. Anoreksija. Dijareja. Povećani nivoi transaminaza. Hipotenzija. tahikardija. dispneja. Vrtoglavica. Poremećaji spavanja. Bol u kostima i zglobovima. Vrućica. Slabost. Mijalgija. Glavobolja. Mučnina. Povraćanje; kod dugotrajne upotrebe - gubitak kose.Ovaj odjeljak predstavlja uputstvo za upotrebu interferona alfa 2b i alfa 2a prve generacije, koje se još nazivaju i linearne, jednostavne ili kratkotrajne. Jedina prednost ovih preparata je njihova relativno niska cijena.
Davne 1943. V. i J. Heile su otkrili takozvani fenomen interferencije. Početna ideja interferona bila je sljedeća: faktor koji sprječava razmnožavanje virusa. Godine 1957. engleski naučnik Alik Isaacs i švajcarski istraživač Jean Lindenman izolovali su ovaj faktor, jasno ga opisali i nazvali interferonom.
Interferon (IFN) je proteinski molekul koji se proizvodi u ljudskom tijelu. Ljudski genetski aparat kodira "recept" za njegovu sintezu (gen za interferon). Interferon je jedan od citokina, signalnih molekula koji igraju važnu ulogu u funkcionisanju imunog sistema.
Više od pola veka od otkrića IFN-a, proučavano je na desetine svojstava ovog proteina. S medicinskog gledišta, glavne su antivirusne i antitumorske funkcije.
Ljudsko tijelo proizvodi oko 20 vrsta - cijelu porodicu - interferona. IFN se dijeli na dva tipa: I i II.
IFN tipa I - alfa, beta, omega, teta - proizvodi i luči većina ćelija u tijelu kao odgovor na djelovanje virusa i nekih drugih agenasa. IFN tipa II uključuje interferon gama, koji proizvode ćelije imunološkog sistema kao odgovor na djelovanje stranih agenasa.
U početku su se preparati interferona dobivali samo iz krvnih stanica donora; Zvali su se tako: leukocitni interferoni. Godine 1980. počela je era rekombinantnih ili genetski modifikovanih interferona. Proizvodnja rekombinantnih lijekova postala je znatno jeftinija od proizvodnje sličnih lijekova od krvi ljudskih donatora ili drugih bioloških sirovina; ne koriste se u njihovoj proizvodnji krv davaoca koji mogu poslužiti kao izvor infekcije. Rekombinantni lijekovi ne sadrže strane nečistoće i stoga imaju manje nuspojave. Njihov ljekoviti potencijal je veći od onih sličnih prirodnih lijekova.
Za liječenje virusnih bolesti, posebno hepatitisa C, uglavnom se koristi interferon alfa (IFN-α). Postoje "jednostavni" ("kratkotrajni") interferoni alfa 2b i alfa 2a i pegilirani (peginterferon alfa-2a i peginterferon alfa-2b). „Jednostavni“ interferoni se praktički ne koriste u EU i SAD-u, ali se kod nas, zbog svoje uporedne jeftinosti, koriste prilično često. U liječenju hepatitisa C koriste se oba oblika “kratkog” IFN-α: interferon alfa-2a i interferon alfa-2b (razlikuje se u jednoj aminokiselini). Injekcije sa jednostavnim interferonima obično se rade svaki drugi dan (sa peginterferonima - jednom sedmično). Efikasnost liječenja kratkotrajnim IFN-ima kada se primjenjuje svaki drugi dan je niža nego s peginterferonima. Neki stručnjaci preporučuju svakodnevne injekcije „jednostavnog“ IFN-a, jer je efikasnost AVT nešto veća.
Raspon “kratkih” IFN-a je prilično širok. Pušteni su od strane različitih proizvođača ispod različita imena: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona i drugi.
Najviše proučavani (a samim tim i skupi) su Roferon-A i Intron-A. Efikasnost liječenja ovim IFN-ima u kombinaciji sa ribavirinom, ovisno o genotipu virusa i drugim faktorima, kreće se od 30% do 60%. Lista glavnih brendovi Proizvođači jednostavnih interferona i njihovi opisi dati su u tabeli.
Sve interferone treba čuvati u frižideru (od +2 do +8 stepeni Celzijusa). Ne smiju se zagrijavati ili smrzavati. Nemojte tresti ili izlagati lijek direktnom utjecaju sunčeve zrake. Droge je potrebno transportovati u posebnim kontejnerima.
tvar-rastvor: pakovanja Reg. Broj: LSR-007009/08
Klinička i farmakološka grupa:
Oblik puštanja, sastav i pakovanje
supstance -rešenje.
boce (1) - kartonska pakovanja.
Opis aktivnih komponenti lijeka " Interferon alfa-2b»
farmakološki efekat
Interferon. To je visoko pročišćeni rekombinantni protein s molekulskom težinom od 19.300 daltona. Dobiven iz klona Escherichia coli hibridizacijom bakterijskih plazmida sa genom za humane leukocite koji kodira sintezu interferona. Za razliku od interferona, alfa-2a ima arginin na poziciji 23.
Ima antivirusno djelovanje, što je posljedica interakcije sa specifičnim membranskim receptorima i indukcije sinteze RNK i, konačno, proteina. Potonji, zauzvrat, sprječavaju normalnu reprodukciju virusa ili njegovo oslobađanje.
Ima imunomodulatorno djelovanje, što je povezano s aktivacijom fagocitoze, stimulacijom stvaranja antitijela i limfokina.
Ima antiproliferativni učinak na tumorske ćelije.
Indikacije
akutni hepatitis B, hronični hepatitis B, hronični hepatitis C.
Leukemija dlakavih ćelija, hronična mijeloična leukemija, karcinom bubrežnih ćelija, Kaposijev sarkom zbog AIDS-a, kožni T-ćelijski limfom (mycosis fungoides i Sézaryjev sindrom), maligni melanom.
Režim doziranja
Primjenjuje se intravenozno ili subkutano. Doza i režim liječenja određuju se pojedinačno, ovisno o indikacijama.
Nuspojava
Simptomi slični gripi: često - groznica, zimica, bol u kostima, zglobovima, očima, mijalgija, glavobolja, pojačano znojenje, vrtoglavica.
Izvana probavni sustav: mogući gubitak apetita, mučnina, povraćanje, dijareja, zatvor, smetnje senzacije ukusa, suha usta, gubitak težine, blagi bol u trbuhu, blage promjene u testovima funkcije jetre (obično se normaliziraju nakon tretmana).
Iz centralnog i perifernog nervnog sistema: rijetko - vrtoglavica, pogoršanje mentalne aktivnosti, poremećaj sna, oštećenje pamćenja, anksioznost, nervoza, agresivnost, euforija, depresija (nakon dugotrajno liječenje), parestezija, neuropatija, tremor; u nekim slučajevima - suicidalne tendencije, pospanost.
Iz kardiovaskularnog sistema: moguće - tahikardija (sa groznicom), arterijska hipotenzija ili hipertenzija, aritmija; u nekim slučajevima - poremećaji kardiovaskularnog sistema, koronarne arterijske bolesti, infarkt miokarda.
Iz respiratornog sistema: rijetko - bol u grudima, kašalj, blagi nedostatak daha; u nekim slučajevima - upala pluća, plućni edem.
Iz hematopoetskog sistema: moguća blaga leukopenija, trombocitopenija, granulocitopenija.
Dermatološke reakcije: mogući svrab, reverzibilna alopecija.
Ostalo: rijetko - ukočenost mišića; u izolovanim slučajevima - antitijela na prirodne ili rekombinantne interferone.
Kontraindikacije
Teška kardiovaskularne bolesti, dekompenzirana ciroza jetre, teška depresija, psihoza, ovisnost o alkoholu ili drogama, povećana osjetljivost na interferon alfa-2b.
Trudnoća i dojenje
Upotreba tokom trudnoće je moguća samo ako očekivana korist terapije za majku nadmašuje potencijalni rizik za fetus.
Nije poznato da li se interferon alfa-2b izlučuje iz majčino mleko. Ako je neophodno koristiti ga tokom dojenja, treba odlučiti o pitanju prekida dojenja.
Žene u reproduktivnoj dobi trebale bi koristiti pouzdanu kontracepciju tokom liječenja.
Koristi se za disfunkciju jetre
Kontraindicirano kod dekompenzirane ciroze jetre. Koristiti s oprezom kod pacijenata sa oštećenom funkcijom jetre.
Koristiti kod oštećenja bubrega
Koristiti s oprezom kod pacijenata sa oštećenom funkcijom bubrega.
specialne instrukcije
S oprezom koristiti kod pacijenata sa oštećenom hematopoezom bubrega, jetre, koštane srži ili sa tendencijom samoubistva.
Kod pacijenata sa oboljenjima kardiovaskularnog sistema moguća je aritmija. Ako se aritmija ne smanji ili poveća, dozu treba smanjiti za 2 puta ili prekinuti liječenje.
Tokom perioda lečenja neophodno je praćenje neurološkog i mentalnog statusa.
U slučajevima teške supresije hematopoeze koštane srži neophodno je redovno ispitivanje sastava periferne krvi.
Interferon alfa-2b ima stimulativni učinak na imuni sistem i treba ga koristiti s oprezom kod pacijenata sklonih autoimunim bolestima zbog povećanog rizika od autoimunih reakcija.
Interakcije lijekova
Interakcije lijekova
Interferon alfa-2b inhibira metabolizam teofilina i smanjuje njegov klirens.
