Fibroblastos. Funciones de los fibroblastos

La principal actividad de la modernidad. medicina estetica- prevención del envejecimiento mediante alta tecnología. Como resultado investigación científica Se ha identificado un patrón de que las células tienen la capacidad de regenerarse. Estas propiedades también lo tienen los fibroblastos, cuya regeneración conduce al rejuvenecimiento de la piel y a la eliminación de defectos visibles en la misma.

Funciones y naturaleza de los fibroblastos.

El término "fibroblastos" consta de dos palabras latinas traducidas literalmente como "brote" y "fibra". Por su naturaleza son células. tejido conectivo, sintetizando la matriz extracelular (estructura tisular que asegura la transferencia quimicos y soporte mecánico de las células de la piel). Los fibroblastos producen sustancias que son precursoras de fibras de colágeno y elastina, ácido hialurónico y fibrina.

Provienen del mesénquima, un tejido germinal que se encuentra en las células del cuerpo de humanos y animales. En estado activo, la estructura de los fibroplastos implica la presencia de un núcleo y procesos; tienen un tamaño aumentado y contienen una gran cantidad de ribosomas, en estado de reposo disminuyen de tamaño y adquieren una forma de huso.

Los fibroblastos de la piel tienen amplia gama funciones. Gracias a su presencia en el organismo se producen los siguientes procesos:

• Activación de los procesos de síntesis de colágeno y elastina.
• Formación de vasos sanguíneos.
• Dirigir las células del sistema inmunológico hacia bacterias y partículas extrañas.
• Aceleración del crecimiento de los tejidos.
• Aumento del crecimiento celular.
• Curación de zonas dañadas de la piel.
• Producción de diversas proteínas (proteoglicanos, lamininas y otras).

Causas de los cambios relacionados con la edad.

La juventud de la piel está determinada por el proceso cíclico de producción de colágeno y elastina, que posteriormente se descomponen en sus componentes, que son utilizados por los fibroblastos para reproducirlos.

Con el tiempo, estos últimos reducen su actividad, dejando de producir fibras de colágeno y elastina, lo que finalmente provoca el envejecimiento de la piel. Cambios relacionados con la edad Comienzan a aparecer entre los 28 y 30 años. Se expresan en pérdida de elasticidad y desarrollo de ptosis, cambios en el color de la piel, aumento de la sequedad y formación de arrugas. Y todo ello debido a que cada década los fibroblastos disminuyen un 10%.

número original

Reposición de fibroblastos Entonces, para frenar el envejecimiento y restaurar la juventud, es necesario restaurar los fibroblastos.

. La mayoría de las técnicas cosméticas modernas conducen sólo a una aceleración temporal de la síntesis de fibras de colágeno, pero no aumentan las células en sí. Durante mucho tiempo se aceptó generalmente que esto era sencillamente imposible. Hoy en día, la ciencia ha avanzado mucho y la restauración de fibroblastos ya no es una fantasía. este procedimiento

Se llama terapia SPRS y se practica ampliamente en Estados Unidos, países europeos y, más recientemente, en Rusia.

Terapia SPRS: características y principio de implementación.

Restaurar los fibroblastos no es fácil; requiere pasar por un complejo procedimiento de inyección. Los resultados de su implementación son el engrosamiento de la piel y un aumento de su elasticidad, prevención y reducción de la ptosis. También se reducen las arrugas, desaparece la pigmentación y se suavizan las cicatrices.

La terapia comienza con la recolección de células del paciente de la piel ubicada detrás de la aurícula. La muestra resultante se utiliza para diagnóstico y estudio, denominada biomaterial. Se utiliza para desarrollar un régimen de tratamiento y recrear artificialmente fibroblastos, que posteriormente se inyectarán nuevamente en la piel mediante inyecciones.

El cuerpo no rechaza las células cultivadas a partir de biomateriales de pacientes. Después del trasplante, permanecen activos durante un año y medio, durante el cual mejora el estado de la piel. No se recomienda la administración de fibroblastos mediante inyección durante la exacerbación de enfermedades crónicas, resfriados, infecciones virales acompañadas de temperatura elevada cuerpos. Las contraindicaciones incluyen inmunodeficiencia, formaciones malignas , infecciones y enfermedades cronicas V. Antes de realizar el procedimiento, se requiere una consulta preliminar con un especialista para identificar contraindicaciones individuales.

El procedimiento no dura más de una hora y se realiza en 2 sesiones con un descanso de 5 a 7 semanas. Antes de las inyecciones, se requiere anestesia local.

Introducir fibroblastos es un placer caro. Espectro completo Los servicios, incluida la recogida, el almacenamiento, la investigación y la administración de biomateriales, se estiman en unos 400.000 rublos.

Video: realización de terapia SPRS.

Los fibroblastos son células del tejido conectivo que aseguran la producción de colágeno y elastina, manteniendo así la juventud de nuestra piel. Con el tiempo, su número en el cuerpo disminuye constantemente, por lo que aparecen signos externos de cambios relacionados con la edad. La restauración del número de fibroblastos se lleva a cabo mediante una técnica de inyección basada en células cultivadas artificialmente.

fibroblastos- células principales del tejido conectivo laxo, que producen componentes de la sustancia intercelular. Se trata de células ramificadas, fusiformes o extendidas que miden unas 20 micras. En ellos están bien desarrollados los orgánulos del entorno metabólico interno. El núcleo de los fibroblastos tiene forma ovalada, contiene cromatina uniformemente dispersa y 2-3 nucléolos. El citoplasma está claramente dividido en endoplasma intensamente teñido y ectoplasma débilmente teñido. El citoplasma de los fibroblastos (especialmente los jóvenes) es basófilo. Revela un retículo endoplásmico bien desarrollado con una gran cantidad de ribosomas unidos a membranas en forma de cadenas de 10 a 30 gránulos. Esta ultraestructura del retículo endoplásmico granular es característica de las células que sintetizan activamente proteínas "para exportar". También hay numerosos ribosomas libres y un complejo de Golgi bien desarrollado. Las mitocondrias son grandes, su número es pequeño. Los métodos citoquímicos han demostrado la presencia de enzimas glicolíticas y enzimas hidrolíticas de los lisosomas (especialmente colagenasa) en el citoplasma de los fibroblastos. Las enzimas oxidativas de las mitocondrias son menos activas.

Sistema musculoesquelético de la célula. asegura su movilidad, cambio de forma, unión al sustrato, tensión mecánica de la película a la que se une la célula en cultivo. Hay muchas microvellosidades y proyecciones vesiculares en la superficie celular. Los fibroblastos suspendidos en un medio líquido tienen forma esférica. El fibroblasto se extiende después de adherirse a una superficie sólida, a lo largo de la cual se mueve gracias a los pseudópodos.

La función principal de los fibroblastos.- síntesis y secreción de proteínas y glucosaminoglicanos utilizados para formar componentes de la sustancia intercelular del tejido conectivo, así como la producción y secreción de factores estimulantes de colonias (granulocitos, macrófagos). fibroblastos por mucho tiempo conservar la capacidad de proliferar. Los fibroblastos que han completado su ciclo de desarrollo se denominan fibrocitos. Estas son células de larga vida. El citoplasma celular pierde orgánulos, la célula se aplana y el potencial proliferativo disminuye. Sin embargo, la célula no pierde la capacidad de participar en la regulación. procesos metabólicos en tela.

Sustancia intercelular. Consta de componentes fibrilares y básicos (amorfos). Utilizando métodos de histoautorradiografía con la introducción de aminoácidos marcados (3H-prolina, 3H-glicina, etc.), se estableció que las moléculas de proteínas se sintetizan en polisomas de fibroblastos. Los fibroblastos pueden sintetizar simultáneamente varios tipos de proteínas y glucosaminoglicanos específicos. Para la síntesis de proteína de colágeno es esencial la presencia de vitamina C, cuya deficiencia se inhibe drásticamente la colagenogénesis. La síntesis de sustancias intercelulares se produce de forma más intensa en condiciones de concentración reducida de oxígeno. Simultáneamente con la síntesis de colágeno, el fibroblasto destruye aproximadamente 2/3 de esta proteína utilizando la enzima colagenasa, que previene la esclerosis tisular prematura.

Moléculas de procolágeno sintetizadas. Son llevados a la superficie de los fibroblastos por exocitosis. En este caso, la proteína pasa de una forma soluble a una insoluble: el tropocolágeno. La combinación de moléculas de tropocolágeno en estructuras supramoleculares (fibrillas de colágeno) se produce en las inmediaciones de la superficie celular debido a la acción de sustancias especiales secretadas por la célula. En particular, se encontró una proteína, la fibronectina, en la superficie de los fibroblastos, que realiza funciones adhesivas y de otro tipo. Las etapas posteriores de la fibrilogénesis ocurren por polimerización y agregación de tropocolágeno en fibrillas previamente formadas. En este caso, la maduración de las fibras de colágeno puede ocurrir sin conexión directa con los fibroblastos.
Glicosaminoglicanos son reguladores de la formación de colágeno y forman parte del componente principal (amorfo) de la sustancia intercelular.

Componente fibrilar La sustancia intercelular del tejido conectivo laxo incluye tres tipos de fibras: colágenas, elásticas y reticulares. Tienen un mecanismo de formación similar, pero se diferencian entre sí en composición química, ultraestructura y propiedades físicas. La proteína de colágeno se identifica por su composición de aminoácidos y la secuencia de aminoácidos en la molécula de colágeno. Dependiendo de la variación de los aminoácidos en la cadena polipeptídica, propiedades inmunes, peso molecular, etc., se distinguen 14 o más variedades de proteínas de colágeno, que forman parte del tejido conectivo de los órganos. Todos ellos componen 4 tipos o clases principales de colágeno.

colágeno tipo 1 Se encuentra en conectivo y tejido óseo, así como en la esclerótica y córnea del ojo; Tipo II - en tejidos cartilaginosos; Tipo III: en la pared de los vasos sanguíneos, en el tejido conectivo de la piel del feto; Tipo IV-ro - en membranas basales.

fibroblastos(fibroblastocitos) (del latín fibra - fibra, griego blastos - brote, germen): células que sintetizan componentes de la sustancia intercelular: proteínas (por ejemplo, colágeno, elastina), proteoglicanos, glicoproteínas.

En el período embrionario, varias células mesenquimales del embrión dan lugar a diferenciación de fibroblastos, que incluye:

· células madre,

células progenitoras semi-tallo,

· fibroblastos no especializados,

fibroblastos diferenciados (maduros, en funcionamiento activo),

fibrocitos (definitivo formas celulares),

miofibroblastos y fibroclastos.

CON función principal Los fibroblastos están asociados con la formación de la sustancia principal y las fibras (que se manifiesta claramente, por ejemplo, durante la cicatrización de heridas, el desarrollo de tejido cicatricial, la formación de una cápsula de tejido conectivo alrededor de un cuerpo extraño).

Los fibroblastos poco especializados son células con pocas prolongaciones con un núcleo redondo u ovalado y un nucléolo pequeño, citoplasma basófilo, rico en ARN. El tamaño de la celda no supera los 20-25 micrones. En el citoplasma de estas células se encuentra una gran cantidad de ribosomas libres. El retículo endoplásmico y las mitocondrias están poco desarrollados. El aparato de Golgi está representado por grupos de tubos cortos y vesículas.
En esta etapa de la citogénesis, los fibroblastos tienen niveles muy bajos de síntesis y secreción de proteínas. Estos fibroblastos son capaces de reproducción mitótica.

Los fibroblastos maduros diferenciados son de mayor tamaño. Estas son células que funcionan activamente.

En los fibroblastos maduros, se lleva a cabo una biosíntesis intensiva de colágeno, proteínas elastina y proteoglicanos, que son necesarios para la formación de la sustancia principal y las fibras. Estos procesos se mejoran en condiciones de baja concentración de oxígeno. Los factores estimulantes para la biosíntesis de colágeno son también los iones de hierro, cobre, cromo, ácido ascórbico. Una de las enzimas hidrolíticas es colagenasa- descompone el colágeno inmaduro dentro de las células, lo que regula la intensidad de la secreción de colágeno a nivel celular.

Los fibroblastos son células móviles. En su citoplasma, especialmente en la capa periférica, se encuentran microfilamentos que contienen proteínas como la actina y la miosina. El movimiento de los fibroblastos sólo es posible después de que se unen a estructuras fibrilares de soporte mediante fibronectina- una glicoproteína sintetizada por fibroblastos y otras células, que garantiza la adhesión de células y estructuras no celulares. Durante el movimiento, el fibroblasto se aplana y su superficie puede aumentar 10 veces.

El plasmalema de los fibroblastos es una importante zona receptora que media los efectos de diversos factores reguladores. La activación de los fibroblastos suele ir acompañada de la acumulación de glucógeno y una mayor actividad de las enzimas hidrolíticas. La energía generada por el metabolismo del glucógeno se utiliza para sintetizar polipéptidos y otros componentes secretados por la célula.

Según su capacidad para sintetizar proteínas fibrilares, la familia de los fibroblastos incluye células reticulares del tejido conectivo reticular de los órganos hematopoyéticos, así como condroblastos y osteoblastos de la variedad esquelética del tejido conectivo.

fibrocitos- formas definitivas (finales) de desarrollo de fibroblastos. Estas células tienen forma de huso y procesos pterigoideos. [Contienen una pequeña cantidad de orgánulos, vacuolas, lípidos y glucógeno.] La síntesis de colágeno y otras sustancias en los fibrocitos se reduce drásticamente.

Miofibroblastos- células similares a los fibroblastos, que combinan la capacidad de sintetizar no solo colágeno, sino también proteínas contráctiles en cantidades significativas. Los fibroblastos pueden transformarse en miofibroblastos, que son funcionalmente similares a los lisos. células musculares, pero a diferencia de estos últimos tienen un retículo endoplasmático bien desarrollado. Estas células se observan en el tejido de granulación de las heridas en proceso de cicatrización y en el útero durante el embarazo.

fibroclastos- las células con alta actividad fagocítica e hidrolítica participan en la "resorción" de la sustancia intercelular durante el período de involución de los órganos (por ejemplo, en el útero después del embarazo). Combinan las características estructurales de las células formadoras de fibrillas (retículo endoplasmático granular desarrollado, aparato de Golgi, mitocondrias relativamente grandes pero pocas), así como lisosomas con sus enzimas hidrolíticas características. El complejo de enzimas que secretan fuera de la célula descompone la sustancia cementante de las fibras de colágeno, tras lo cual se produce la fagocitosis y la digestión intracelular del colágeno.

Las siguientes células del tejido conectivo fibroso ya no pertenecen a la diferenciación de fibroblastos.

Los fibroblastos de la piel forman la base del tejido conectivo. Son productores de ácido hialurónico, fibras de colágeno y elastina. Los cambios relacionados con la edad ralentizan el funcionamiento de los fibroblastos, lo que hace que la piel se vuelva delgada y flácida. gracias al celular tecnología de inyección el cuerpo inicia de forma independiente la función de rejuvenecer la estructura de la dermis.

La esencia de los fibroblastos.

Fibroblastos de piel- Se trata de células de la capa de tejido conectivo de la dermis, cuyos predecesores fueron las células madre. Vienen en dos formas:

1. Activo: células grandes, equipadas con un núcleo plano de forma ovalada, una gran cantidad de ribosomas y procesos. Se caracterizan por una división intensiva, producción de colágeno y otros componentes de la matriz.
2. Inactivos (fibrocitos): las células son un poco más pequeñas y tienen forma de huso. Se forman a partir de fibroblastos y no pueden dividirse. Participa en la síntesis de fibras y en la regeneración de heridas.

A medida que el cuerpo envejece, la cantidad de fibroblastos disminuye y su actividad disminuye. Esto conduce a un deterioro en la síntesis de sustancias intercelulares. Este proceso se refleja en la piel en forma de adelgazamiento, sequedad y flacidez. Se estira y se forman arrugas.

Funciones

Una de las principales funciones de los fibroblastos es la producción y regeneración de sustancia intercelular. Al formar factores de crecimiento, componentes de la matriz extracelular, enzimas, contribuyen a la destrucción y nueva síntesis de colágeno y ácido hialurónico. Gracias al proceso continuo, se renueva la sustancia intercelular. Además, producen factores de crecimiento celular:

• El principal es que se estimula el crecimiento de todas las células dérmicas, se produce fibronectina para reacciones protectoras;
• Transformación: se sintetizan fibras de colágeno y elastina, se forman vasos sanguíneos, las células del sistema inmunológico se dirigen a agentes extraños, bacterias;
• Epidérmico: se activan la proliferación de tejidos, el crecimiento celular y el transporte de queratinocitos;
• El crecimiento de los queratinocitos es epitelización, el daño se regenera.

Los factores de crecimiento de fibroblastos están representados por proteínas multifuncionales que son mitógenos y también realizan funciones endocrinas, reguladoras, función estructural. Gracias a los fibroblastos se producen proteínas importantes para la piel: proteoglicanos, tinascina, nidogen y laminina.

La esencia de la técnica.

Terapia SPRS Es una técnica de inyección de rejuvenecimiento cutáneo mediante fibroblastos, eliminando la causa misma del envejecimiento cutáneo. La patente de la tecnología de trasplante intradérmico de autofibroblastos pertenece a la empresa estadounidense FibrocellScience. Gracias a la tecnología celular, es posible cultivar fibroblastos a partir de una partícula de piel humana (biopsia). El biomaterial propio elimina el problema de la compatibilidad de los tejidos y el riesgo de infección. Las células autólogas se perciben positivamente. sistema inmunitario y son capaces de funcionar plenamente.

La muestra se puede tomar a cualquier edad, pero es preferible hacerlo cuando sea joven. La edad recomendada es de 20 a 30 años. Puede guardar un trozo de piel durante cualquier operación y colocar las células aisladas de él en un almacenamiento criogénico durante muchos años. Una temperatura de -196 grados te permite almacenarlos durante toda tu vida, usándolos según sea necesario. Esto le permitirá realizar procedimientos cosméticos eficaces en cualquier momento.

Los propios fibroblastos, junto con las células madre, tienen la propiedad de mantener su potencial durante el envejecimiento. Bajo anestesia local Se toma una pequeña muestra de piel del paciente detrás de la oreja, el ombligo o el antebrazo. Estas áreas están menos expuestas a la radiación ultravioleta. Su tamaño es de unos 4 mm. Los fibroblastos aislados de él se colocan en viales especiales.

Cuando se cultivan en un medio con suero fetal, se estimula la capacidad de proliferación en las células jóvenes y las viejas se eliminan. Hay un “rejuvenecimiento” de la cultura. Después de un mes, el número de células aumenta varios miles de veces. Después de la reactivación, el cultivo celular se trasplanta al paciente y llena activamente la dermis. Después de un mes y medio, los fibroblastos multiplicados se inyectan en la piel del rostro del paciente, también alrededor de los ojos, así como en el cuello, el escote y los brazos.

Procedimiento

El curso consta de 3-5 sesiones, cuyos intervalos oscilan entre 3 y 6 semanas. Etapas del procedimiento:

• examen del paciente para identificar contraindicaciones existentes;
• tomar material;
• cultivo de fibroblastos;
• inyección de material celular en la piel mediante dos métodos: túnel - en pliegues cutáneos profundos, mesoterapia papular;
• protegiendo la piel de la radiación ultravioleta mediante la aplicación de crema.

Los pacientes notan que el procedimiento es doloroso, por lo que se utiliza la crema anestésica Emla. La cantidad de fármaco utilizada es de hasta 3 ml por sesión. El período de recuperación dura 2-3 días. Después del procedimiento, está prohibido aplicar cosméticos. Durante dos semanas debes abstenerte de visitar la sauna o la casa de baños. Hay que proteger la piel del sol lubrificándola con una crema con un alto grado de protección. Se recomienda repetir el procedimiento una vez al año. El resultado es una mejora del estado de la piel del rostro durante varios meses.

Eficiencia y ventajas del método.

El rejuvenecimiento con fibroblastos da los primeros resultados después de 1,5 o 2 meses. Efecto completo El efecto del procedimiento aparece después de seis meses y dura de 2 a 3 años. Comienza la producción mejorada de factores de crecimiento y matriz extracelular. Los fibroblastos pasan por fases naturales del ciclo: se activan, sintetizan elastina, colágeno y otras sustancias, luego comienza la fase de degradación, reemplazándolos por nuevos fibroblastos.

Su uso está muy extendido en medicina: contra quemaduras, para la regeneración de tejidos durante úlceras tróficas, heridas Su importancia en cosmetología es grande. La juventud de la piel está formada por la cantidad de fibroblastos. Colocados en la dermis, los fibroblastos crecidos se incrustan en los tejidos, iniciando la producción de colágeno y elastina. Como resultado, la piel se vuelve elástica, adquiere un color uniforme y las arrugas finas desaparecen.

Pero no se debe esperar un efecto tensor del procedimiento. Esta técnica tiene como objetivo mejorar las características de calidad de la piel. Las principales ventajas de la terapia SPRS:

• el fármaco actúa con genes, lo que elimina la alteración de la estructura primaria de la piel;
• se activan los procesos de rejuvenecimiento natural;
• seguridad, sin riesgo de rechazo, reacción alérgica;
• preservación a largo plazo del resultado.

En 6 meses, las arrugas alrededor de los ojos se suavizan en un 90%. El escote y el cuello lucen un 95% más jóvenes y las mejillas un 87%. Los pliegues alrededor de la boca se reducen en un 55%.

Contraindicaciones

A pesar de la total seguridad, el procedimiento tiene algunas contraindicaciones:

• embarazo, período de lactancia;
• alteración de la coagulación sanguínea;
• neoplasias malignas;
• enfermedades autoinmunes;
• predisposición a la formación de cicatrices;
• ARVI;
• inflamación en la piel.

Durante el día siguiente a la sesión se pueden observar enrojecimientos en la piel y microhematomas. Al día siguiente los síntomas desaparecen.

La tecnología de trasplante de autofibroblastos cuenta con el permiso oficial de Roszdravnadzor. Su seguridad se confirma mediante el control de laboratorio de la viabilidad celular.

Titulares de la patente RU 2536992:

La invención se relaciona con el campo de la biotecnología, específicamente con las tecnologías celulares, y puede ser utilizada en medicina. El método consiste en escalar células diploides de la línea M-20 del criobanco del IPVE que lleva su nombre. MP Chumakov Academia Rusa de Ciencias Médicas a partir de una ampolla de un banco de células de semillas del pasaje 7 para obtener un banco de células de trabajo del pasaje 16. En este caso, las células de 20-33 pases, adecuadas para su uso con fines terapéuticos y/o de diagnóstico, se obtienen cultivando en un medio nutritivo que contiene un 10% de plasma fibrinolíticamente activo (FAP) de una persona que contiene factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF en una concentración de 155 a 342 pg/ml. La invención permite incrementar la actividad proliferativa de células de fibroblastos humanos diploides. 1 salario archivos, 2 tablas.

La invención se refiere a biotecnología, inmunología, medicina, en particular a un método para aumentar las propiedades proliferativas de las células de fibroblastos humanos diploides para el uso de dichas células con fines terapéuticos y de diagnóstico, incluso para determinar la actividad antiviral de los interferones humanos, para el reemplazo celular. terapia.

Las líneas celulares diploides humanas (HDCL) tienen ventajas innegables sobre todos los tipos conocidos de cultivos celulares en su capacidad para mantener características biológicas y genéticas estables durante los pases. La certificación de los países LDCC destinados a la producción de vacunas se lleva a cabo de acuerdo con requisitos uniformes desarrollados por la Organización Mundial de la Salud. Estas recomendaciones se toman como base para los criterios nacionales para la certificación de la vacuna LDKCH, desarrollados por el Instituto Estatal de Investigación de Enfermedades Clínicas Infecciosas que lleva su nombre. LA. Tarasevich y el Ministerio de Salud de la URSS [ Recomendaciones metodológicas“Certificación de líneas celulares continuas - sustratos para la producción y control de medicamentos preparaciones inmunobiológicas» RD-42-28-10-89. Ministerio de Salud de la URSS. M., 1989. - Pág. 16]. La línea certificada de células diploides humanas tiene una vida útil limitada y características biológicas, culturales y genéticas estables, está libre de contaminantes (bacterias, hongos, micoplasmas, virus) y no provoca formación de tumores en animales inmunodeprimidos. La línea celular diploide debe contar con un banco de células semilla certificado en niveles de pases tempranos (hasta el pase 10), compuesto por al menos 200 crioviales. Al pasar células semilla de uno o varios crioviales al nivel de pase 16, se obtiene un banco de células de trabajo, del cual se pueden obtener los cultivos productores necesarios para la producción o para trabajo de investigacion. En Rusia y en el extranjero sólo existen unas pocas líneas celulares diploides humanas (Wi-38, MRC-5, M-22, etc.) certificadas según los requisitos enumerados. Los LDCV certificados se utilizan en la producción de vacunas contra la polio, el sarampión, la rubéola, la rabia, las enfermedades respiratorias y infecciones por citomegalovirus, así como interferón [T.K. Borisova, L.L. Mironova, O.I. Konyushko, V.D. Popova, V.P. Grachev, N.R. Shujmina, V.V. Zvérev. Las cepas domésticas de células diploides humanas son un sustrato para la producción de vacunas. Virología médica. Materiales congreso científico-práctico « Problemas actuales virología médica, dedicada al centenario de M.P. Chumákov." M. 2009. Tomo XXVI. págs. 305-307; L.L. Mironova, V.D. Popova, O.I. Konyushko. Experiencia en la creación de un banco de líneas originales de células trasplantables y su uso en la práctica virológica. Biotecnología. 2000, pág. 41-47]. Los LDCN se utilizan ampliamente in vitro para el diagnóstico de infecciones virales y análisis de toxicidad. varias drogas y productos para terapia de reemplazo [Patente RF No. 2373944, 23/06/2008. Método de tratamiento herida por quemadura. COMO. Ermolov, S.V. Smirnov, V.B. Jvatov, L.L. Mirónov; SV Smirnov, V.B. Hvatov. Tecnologías innovadoras tratamiento local de quemaduras en el Instituto de Investigación de Medicina de Emergencia que lleva su nombre. NEVADA. Sklifosovsky. En el libro: Nueva Economía. Un retrato innovador de Rusia. M., Centro de Asociación Estratégica, 2009. págs. 388-390].

En IPVE estoy. MP Chumakov RAMS En los años 80 del siglo XX, se establecieron varias líneas de células diploides a partir de la piel y los músculos de embriones humanos de 8 a 10 semanas de edad. Este trabajo está dedicado a modificar la producción de células diploides humanas con fines de diagnóstico y terapia de reemplazo celular, es decir, la producción de células diploides de fibroblastos humanos con mayores propiedades proliferativas.

Prototipo. Patente de RF No. 1440029 del 22 de marzo de 1993 [Mironova L.L., Preobrazhenskaya N.K., Solovyova M.N., Orlova T.G. Stobetsky V.I., Kryuchkova G.P., Karmysheva V.Ya., Kudinova S.I., Popova V.D., Alpatova G.A. IPVE y NIIEiM im. n.f. Gamaleya. Una cepa de células musculares y cutáneas embrionarias humanas diploides utilizadas como sistema de prueba para determinar la actividad antiviral de los interferones humanos y la propagación de virus].

Esta cepa LDCC se denomina M-21, sin embargo, el cultivo de fibroblastos M-21 tenía una actividad proliferativa insuficiente, lo que redujo el tiempo de formación de la monocapa y aumentó el consumo de células y materiales, lo que finalmente condujo al agotamiento completo de sus reservas. Como resultado, surgió la necesidad de una nueva línea celular, adecuada para determinar la actividad antiviral de los interferones humanos y otros fines médicos y biológicos, más rentable, caracterizada por una alta actividad proliferativa y que tenga bancos de semillas y células de trabajo. Esta línea se denomina M-20. En el nivel de pasaje 7, se preparó un banco de células de semillas. En 2012, se construyó un banco de celdas de trabajo en el nivel del pasaje 16 a partir de una ampolla del banco del pasaje 7. Los bancos de semillas y células de trabajo en los niveles 7 y 16 se almacenan en el Instituto de Recipientes de Física Experimental que lleva su nombre. MP Chumakov RAMS y nos permite proporcionar ambos procesos de producción y la investigación científica.

La diferencia entre la presente invención y el análogo más cercano (prototipo) es el aumento de la actividad proliferativa de las células M-20 cuando se utiliza plasma fibrinolíticamente activo (FAP) al 10%.

Así, el objeto de la invención es un método para incrementar las propiedades proliferativas de células de fibroblastos humanos diploides con fines médicos y biológicos mediante el cultivo de células procedentes del criobanco del Instituto de Física Veterinaria que lleva su nombre. MP Academia Rusa de Ciencias Médicas Chumakov, en la que se utilizan células diploides de la línea M-20 caracterizada, que se escalan a partir de la ampolla de un banco de células semilla del pasaje 7 y se obtiene un banco de células de trabajo del pasaje 16, con células de los pasajes 20-33 adecuados para su uso con fines terapéuticos y/o de diagnóstico, obtenidos mediante cultivo en un medio nutritivo que contiene un 10% de plasma fibrinolíticamente activo (FAP) de una persona. En el cultivo de células se utiliza preferentemente el medio nutritivo DMEM con 10% de FAP.

Las células diploides humanas de la línea M-20 caracterizada, obtenidas mediante el método anterior, tienen una alta actividad proliferativa y son adecuadas para su uso con fines terapéuticos y/o de diagnóstico.

Esquema de implementación del método:

1. Se utiliza un criovial del banco de células seminales del séptimo paso del IPVE que lleva su nombre. MP RAMS Chumakova

2. Preparación de un banco de celdas de trabajo a la altura del paso 16 del IPVE que lleva su nombre. MP RAMS Chumakova

3. Recuperación de fibroblastos de la línea M-20 del banco de células de trabajo del pasaje 16 (IPVE que lleva el nombre de M.P. Chumakov, Academia Rusa de Ciencias Médicas).

4. Obtención de un cultivo monocapa de fibroblastos línea M-20, pase 17.

5. Restauración de las propiedades biológicas de los fibroblastos de la línea M-20 mediante triple pase (hasta el vigésimo pase inclusive) para reparar posibles daños en el ADN durante el proceso de criopreservación.

6. Obtención de cultivos celulares con fines de diagnóstico y terapia de reemplazo celular mediante la replicación de fibroblastos de la línea M-20 del pase 20 al 33 utilizando un medio nutritivo que contiene un 10% de plasma fibrinolíticamente activo (con un contenido de PDGF de 155 a 342 pg/ml).

El método propuesto asegura la producción de células con alta actividad proliferativa y adecuadas para su uso en diagnóstico y/o fines medicinales.

Este resultado técnico se logra cultivando fibroblastos humanos de la línea M-20 en un medio nutritivo con la adición de un 10% de plasma fibrinolíticamente activo (FAP), que tiene un efecto estimulante del crecimiento y mejora la actividad proliferativa del cultivo celular.

FAP es un medio de transfusión clínicamente utilizado, que se obtiene de la sangre de personas que murieron repentinamente de infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca aguda, hemorragia cerebral, en las primeras 6 horas después de la muerte [orden del Ministerio de Salud de la URSS No. 482 de junio 14, 1972 “Sobre la mejora del suministro de tejidos cadavéricos a las instituciones y clínicas terapéuticas y profilácticas, médula ósea y sangre"]. La sangre post mortem es un medio de transfusión completo que tiene una serie de propiedades biológicas, principalmente un mayor potencial fibrinolítico. En este sentido, también se propone denominar fibrinólisis sanguínea postmortem. Las principales indicaciones de la transfusión de sangre post mortem: pérdida aguda de sangre, shock, anemia de diversos orígenes, quemaduras, reemplazo metabólico durante envenenamiento exógeno, llenando el AIK cuando se utiliza circulación extracorpórea en cirugía [P.E.G. Tsurinova. Transfusión de sangre fibrinólisis. M., 1960, 159 p.; SV Ryzhkov. Preparación y posibilidades de utilización de sangre para fibrinólisis según el momento de recogida y la causa de la muerte. Resumen del autor. doc. Disculpa. L., 1968, 21 págs.; GEORGIA. Pafomov. Características biológicas de la sangre de fallecidos repentinos y su uso en la práctica quirúrgica. Disentimiento. doc. Miel. Ciencia. M., 1971, 355 págs.; KANSAS. Simonyan, K.P. Gutiontova, E.G. Tsurinova. Sangre post mortem en el aspecto de transfusiología. M., Medicina, 1975, 271 págs.]. Actualmente se utilizan componentes sanguíneos post mortem: plasma fibrinolíticamente activo, masa de glóbulos rojos, masa de leucocitos, masa de plaquetas [G.Ya. Levin. Propiedades de hemocoagulación y aplicación clínica plasma y plaquetas de sangre de cadáver. Resumen del autor. doc. Disculpa. M., 1978, 31 p.; V. B. Hvatov. Preparados de acción fibrinolítica y antiprotenasa a partir del plasma sanguíneo de personas fallecidas repentinamente. Disentimiento. doc. Ciencias Médicas, 1984, 417 págs.; V. B. Khvatov Plasmakinase: una nueva preparación trombolítica a partir de plasma postmortem En: Thrombosis and Thrombolysis edd. E.I. Chazov, V.V. Smirnov). Oficina de Consultores, N.Y., L, 1986, pág. 283-310; V.B. Hvatov. Aspectos médicos y biológicos del uso de sangre póstuma. Boletín de la Academia de Ciencias Médicas de la URSS, 1991, 9, págs. 18-24; V.B. Hvatov. Sangre de cadáver: historia y estado actual del problema. Problema hematol. y desbordamiento. sangre, 1997, 1. S. 51-59]. También han recibido uso clínico los componentes de la sangre cadavérica obtenida de donantes de órganos [un individuo fallecido con el corazón latiendo según las “Instrucciones para determinar la muerte de una persona con base en el diagnóstico de muerte cerebral” de 20 de diciembre de 2001 No. 460, Registro Ministerio de Justicia N° 3170 de 17 de enero de 2002]. El trasplante de órganos, tejidos y células se lleva a cabo de conformidad con la Ley de la Federación de Rusia "sobre trasplantes de órganos y (o) tejidos humanos", según enmendada. leyes federales de 20 de junio de 2000 No. 91-F3, de 16 de octubre de 2006 No. 160-F3; V. B. Jvatov, S.V. Zhuravel, V.A. Gulyaev, E.N. Kobzeva, M.S. Makárov. Utilidad biológica y actividad funcional de los componentes celulares de la sangre de donantes de órganos. Trasplantología, 2011, 4, p. 13-19; Khubutia M.Sh., Khvatov V.B., Gulyaev V.A. etc. Un método para compensar el volumen sanguíneo globular y los efectos inmunomoduladores durante el trasplante. Patente de RF de invención No. 2452519, publ. 10/06/2012, boletín. Núm. 16].

El plasma fibrinolíticamente activo se obtiene de la sangre de personas fallecidas repentinamente, preparada con el conservante Glyugitsir (relación sangre:conservante 4:1) para preservar sus propiedades fibrinolíticamente activas. La separación del plasma de los elementos celulares de la sangre se realiza en una caja estéril, respetando todas las normas de asepsia y antisépticos y es similar a la obtención de plasma de un donante a partir de sangre enlatada de un donante. El uso clínico de FAP en cirugía y traumatología ha revelado el efecto de estimular la cicatrización de heridas [I.Yu. Klyukvin, M.V. Zvezdina, V.B. Jvatov, F.A. Burdiga. Un método para tratar heridas por mordedura. Patente de invención de la Federación de Rusia No. 2372927, publ., 20 de noviembre de 2009, boletín. Núm. 32]. Asociamos este efecto con la presencia de factores estimulantes del crecimiento en la FAP, secretados por plaquetas activadas. Posteriormente identificamos el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) en FAP. El efecto estimulante del crecimiento de la FAP en cultivos de células humanas se ha demostrado en estudios especiales. Las muestras de FAP estudiadas a una concentración del 10% se añadieron a una suspensión celular de fibroblastos humanos de la línea M-20, que contenía un número conocido de células, y se colocaron 10 ml de la mezcla resultante en matraces de cultivo con una superficie de crecimiento de ​​25cm2. Las células se cultivaron durante 3-4 días en una atmósfera de 5% de CO2 y a 37°C. Después de 3 pases, las células cultivadas se contaron en una cámara de Fuchs-Rosenthal y se determinó la relación entre el número de células cultivadas y el número de células plantadas: el índice de proliferación (en la Tabla 1).

De los experimentos realizados se desprende que las propiedades de crecimiento de la FAP proporcionan una alta actividad proliferativa y no difieren de las del suero fetal bovino. Además, la FAP contiene factores de crecimiento de plaquetas humanas, es decir. tipo alogénico, a diferencia del suero fetal bovino, tipo xenogénico. Este hecho es decisivo para el trasplante de células durante la terapia de sustitución. Obsérvese que el efecto estimulante del crecimiento en el cultivo de células M-20 se debe, en particular, a la presencia de PDGF en FAP en una concentración de 155 a 342 pg/ml. Estos datos se obtuvieron utilizando el kit de inmunoensayo Qantikine, Human PDGF-BB de R&D Systems y el sistema Multiskan Ascent de Thermo. La concentración de PDGF-BB en FAP es similar a su contenido en suero. Así, en el suero de los donantes de sangre y de los pacientes examinados, el contenido de PDGF osciló entre 110 y 880 pg/l, con una media de 244 pg/ml, mientras que en el plasma el contenido de PDGF varió entre 0 y 2 pg/ml.

Para comprender mejor la solución técnica propuesta "producción de células diploides humanas de la línea M-20 para fines médicos y biológicos", presentamos el siguiente ejemplo.

Se recuperan del banco de trabajo células de la línea M-20, paso 16. Para hacer esto, el criovial con células se retira del nitrógeno líquido y se coloca en baño de agua a una temperatura de 38°C y después de descongelar, el contenido se transfiere a un recipiente de cultivo con medio nutritivo DMEM que contiene 10% de FAP (con un contenido de PDGF de 155 a 342 pg/ml), se agrega el antibiótico gentamicina a razón de 1 ml de solución al 4% por 1 litro de medio nutritivo. Para formar una monocapa, las células se cultivan durante 4-5 días a 37°C y 5% de CO2 en una atmósfera. Tras la formación de una monocapa de células, se realizan 3 pases sucesivos, necesarios para la reparación del ADN tras la criopreservación. Luego las células se replican del paso 20 al paso 33. Las células de estos pasajes están destinadas a fines biomédicos. La línea celular resultante se caracterizó detalladamente según los requisitos de la OMS y del GNISiK MIBP que lleva su nombre. LA. Tarasevich, incluida la tipificación HLA de la línea celular M-20, así como el estudio de su espectro de citocinas. A continuación se ofrece una descripción comparativa de las propiedades de la línea M-20 y la línea M-22 (Tabla 2). La línea M 22 (fibroblastos diploides humanos) está autorizada como sustrato de vacuna y aprobada para la producción de cualquier tipo de vacunas médicas virales, y también se utiliza para el tratamiento de quemaduras de grados II-IIIA [Patente RF de invención No. 2373944 , 23/06/2008. Método para tratar una herida por quemadura. COMO. Ermolov, S.V. Smirnov, V.B. Jvatov, L.L. Mironova, O.I. Klnyushko, E.A. Zhirkova, B.C. Bocharova].

La línea M-20 se instaló en el IPVE que lleva su nombre. MP Chumakov RAMS en 1986 a partir de la piel y los músculos de un embrión humano de 10 semanas obtenido como resultado de un aborto de una mujer sana. No había antecedentes de cáncer, enfermedades de transmisión sexual, hepatitis o tuberculosis; genético y enfermedades congénitas no se observó en la familia. Medio de cultivo celular DMEM suplementado con 10% de FAP. La proporción de siembra es de 1:3-1:4 dos veces por semana con una dosis de siembra de células de 7 x 10 4 células/ml. La monocapa celular consta de células fusiformes homogéneas orientadas con núcleos ovalados que contienen de 1 a 3 nucléolos y pequeños grupos de cromatina. EN ciclo vital la línea se puede distinguir en 3 fases de desarrollo: formación 1-3 pasajes, crecimiento activo 4-40 y envejecimiento 41-52, luego ocurre la muerte. Las células de la línea tienen un cariotipo humano 2m=46, XY. La línea se caracteriza por una alta estabilidad genética: el 93,3-96,9% de las células tienen un conjunto diploide de cromosomas, las células con un conjunto poliploide no representan más del 1,6%. No se observaron espacios, roturas ni cromosomas en anillo. El número de bandas de las isoenzimas G-6PDE y LDE y su movilidad electroforética coinciden con los de los eritrocitos humanos. Tipo lento G-6FDG. Al sembrar en medios nutritivos selectivos no se detectó contaminación con bacterias, hongos o micoplasmas. Además, no se detectó contaminación por micoplasma al teñir con los fluorocromos de ADN Hochst 33258 y olivomicina, así como método de PCR. Contaminación con virus en experimentos con ratones blancos adultos y lactantes, conejillos de indias, embriones de conejos y pollos, así como en cultivos celulares homólogos y heterólogos. Control de la tumorigenicidad. Cuando las células de la línea se administraron a animales inmunodeprimidos, no se formaron tumores. No se detectó transcriptasa inversa. Marcadores HLA: Clase I: A*(02.03)/B*(07.40)/CW*(03.07). Clase II: DRB1*(15.16)/DQB1*(05.06). Las células de la línea M-20 en el nivel de paso 20 producen ARNm para interferón α (IFNα) e interleucinas: IL1β, 2, 4, 6, 8, 10, 18.

Por tanto, la línea propuesta es diploide: tiene una vida útil limitada, conserva el cariotipo de las células humanas normales durante toda la vida, está libre de contaminantes y no tiene potencial oncogénico. Se ha caracterizado por su seguridad de acuerdo con las recomendaciones de la OMS y los requisitos del Instituto Estatal de Investigación Científica de Enfermedades Clínicas Infecciosas que lleva su nombre. LA. Tarasevich. En IPVE estoy. MP En Chumakov RAMS existen bancos de semillas y células de trabajo que pueden satisfacer todas las necesidades de producción e investigación científica. Las células de la línea M-20 son sensibles a la infección por varios virus. Además, se estudió el espectro de citoquinas de la línea M-20. El conocimiento del espectro de citoquinas de las células permite evaluar con mayor precisión los resultados al determinar el estado del interferón de los pacientes y dar recomendaciones informadas sobre el uso de medicamentos terapéuticos y profilácticos.

Células diploides humanas: los fibroblastos de la cepa M-20 con actividad proliferativa aumentada, obtenidos mediante el método propuesto, se pueden utilizar con fines de diagnóstico, en particular para determinar la actividad del interferón (IFN) en el suero sanguíneo humano, así como con fines medicinales. , por ejemplo, para el tratamiento local de escaras, mordeduras, heridas de larga duración que no cicatrizan y quemaduras.

1. Un método para aumentar las propiedades proliferativas de células diploides de fibroblastos humanos, caracterizado porque son células diploides de la línea M-20 caracterizada del criobanco del Instituto de Vasos que lleva su nombre. MP Se escala Chumakov RAMS a partir de una ampolla de un banco de células semilla del pasaje 7 y se obtiene un banco de células de trabajo del pasaje 16, mientras que las células de los pasajes 20-33, adecuadas para su uso con fines terapéuticos y/o de diagnóstico, se obtienen mediante cultivo en un medio nutritivo que contiene 10% de plasma fibrinolíticamente activo (FAP) humano que contiene factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF en una concentración de 155 a 342 pg/ml.

2. Método según la reivindicación 1, en el que se utiliza el medio nutritivo DMEM con 10% de FAP para el cultivo de células.

Patentes similares:

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Método de obtención de células madre mesenquimales a partir de células madre pluripotentes humanas y de células madre mesenquimales obtenidas por este método // 2528250

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La invención se relaciona con el campo de la biotecnología, específicamente con las tecnologías celulares, y puede ser utilizada en medicina. El método consiste en escalar células diploides de la línea M-20 del criobanco del IPVE que lleva su nombre. MP Chumakov Academia Rusa de Ciencias Médicas a partir de una ampolla de un banco de células de semillas del pasaje 7 para obtener un banco de células de trabajo del pasaje 16. En este caso, se obtienen células de 20-33 pases, adecuadas para uso con fines terapéuticos y de diagnóstico, cultivando en un medio nutritivo que contiene plasma humano fibrinolíticamente activo que contiene factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF en una concentración de 155 a 342 pgml. La invención permite incrementar la actividad proliferativa de células de fibroblastos humanos diploides. 1 salario archivos, 2 tablas.